Nakon 25 dana statičke inkubacije na 28°C, lakaza iz *Pleurotus ostreatus* NRC620 pokazala je najveću aktivnost u mediju za kulturu gljivica. Optimalne vrijednosti pH i temperature za ovaj enzim bile su 3,0 i 70°C, respektivno. Nakon 2 sata inkubacije na 40°C i 50°C, aktivnost enzima zadržala je 68,33% i 59,61%, respektivno. Nakon 2 sata inkubacije u citrat-fosfatnom puferu (pH 7,0), aktivnost enzima ostala je na 100%. Dodatak 10 mM MgSO₄ i CuSO₄ povećao je aktivnost enzima za približno 21% i 35%, respektivno, dok su NaCl, MnCl₂, KCl i CaCl₂ inhibirali aktivnost enzima. Korištenjem ABTS-a kao supstrata, kinetički parametri (Km i Vmax) lakaze *Pleurotus ostreatus* NRC 620 bili su 1,99 mM i 16.217 μmol min−1 L−1, respektivno. Enzimski tretman uzoraka soka od jabuke značajno je smanjio i pH i viskoznost, a ovo smanjenje je bilo u korelaciji s povećanjem vremena skladištenja. Tretman lakazom rezultirao je blagim smanjenjem ukupnog sadržaja fenola u soku od jabuke, ali nije uočeno smanjenje antioksidativne aktivnosti.
Posljednjih godina, istraživači su se fokusirali na primjenu zelene biotehnologije u prehrambenoj industriji. Lakaza je jedan od najkorisnijih enzima u prehrambenoj industriji, a nalazi primjenu u područjima kao što su prerada sokova, pečenje, stabilizacija vina i poboljšanje organoleptičkih svojstava prehrambenih proizvoda.1Mnoge više biljke i mikroorganizmi luče lakazu,2i gljive poput deuteromiceta, askomiceta i bazidiomiceta također mogu proizvoditi lakazu.3Lakaza (EC 1.10.3.2) je plava oksidaza koja reducira molekularni kisik u vodu koristeći sistem koji se sastoji od tri različita atoma bakra, čime oksidira različite fenolne spojeve i aromatične amine. Tokom proizvodnje voćnih i povrtnih sokova, enzimsko i neenzimsko smeđenje su kritična pitanja.4Budući da ove tvari negativno utječu na boju, okus i aromu soka, moraju se ukloniti.5
Od sveg voća, jabuke se najviše konzumiraju u svijetu i u Evropskoj uniji. U 2019. godini, proizvodnja jabuka bila je treća u svijetu, premašujući 87 miliona tona.6Jabuke sadrže brojne fenolne spojeve, uključujući flavonoide i fenolne kiseline poput kofeinske kiseline i hlorogenske kiseline.7Budući da se sok od jabuke obično konzumira u svom bistrom obliku, otprilike 50% do 90% fenolnih komponenti se gubi tokom procesa filtracije.8Danas potrošači imaju tendenciju da biraju minimalno prerađene proizvode, kao što je mutni sok od jabuke s visokim sadržajem polifenola. Međutim, zbog visokog sadržaja fenola, ova vrsta soka od jabuke je posebno podložna promjeni boje i tamnjenju.9Različite tehnologije, uključujući metode termičke obrade poput pasterizacije na 60–90°C, koriste se za smanjenje ili sprječavanje tamnjenja soka od jabuke.10Međutim, prema istraživanju Sauceda-Gálveza11Termička obrada može uništiti isparljive hemikalije i uticati na organoleptička svojstva soka od jabuke. Alternative metodama termičke obrade uključuju superkritični ugljen-dioksid, ultraljubičasto zračenje, ultrazvuk, visoki hidrostatski pritisak ili homogenizaciju pod visokim pritiskom.12Efikasnost ovih tehnologija i prinos odgovarajućih voćnih sokova zavise od korištenih parametara i karakteristika proizvoda. Njihova široka upotreba je ograničena visokim troškovima, negativnim efektima na kvalitet nekih prehrambenih proizvoda ili neadekvatnom inaktivacijom enzima.13,14
Lakaza se može koristiti za stabilizaciju i bistrenje voćnog soka.15Gökmen i dr.16Preporučuje se upotreba lakase za bistrenje voćnog soka jer ona efikasno uklanja fenolne spojeve pretvarajući ih u polimere ili oligomere koji se lako uklanjaju bilo kojom ultrafiltracijskom membranom, omogućavajući soku od jabuke da održi stabilnu boju i bistrinu do šest sedmica na 50°C. Pročišćena lakasa *Trichoderma* imobilizirana je na kuglicama aluminijevog oksida i korištena za selektivno uklanjanje spojeva neugodnog okusa uzrokovanih mikrobnom kontaminacijom soka od jabuke.17
Otprilike 80-90% isparljivih komponenti soka od jabuke su esteri i aldehidi, koji soku daju jedinstvenu aromu.18Lakaza iz *Trametes versicolor* je imobilizirana na jeftinoj podlozi napravljenoj od prirodnih vlakana mladih kokosovih ljuski za bistrenje soka od jabuke.19Prethodne studije su istraživale stabilizaciju soka od jabuke (boja i mutnoća) korištenjem metoda bez enzima ili imobilizacije, ili u kombinaciji s ultrafiltracijom.5,19Međutim, uticaj gljivičnih lakaza na fizičko-hemijska svojstva soka od jabuke tokom skladištenja ostaje nejasan. Stoga je cilj ove studije bio eksperimentalno istražiti promjene u fizičko-hemijskim svojstvima, sadržaju fenolnih jedinjenja i antioksidativnoj aktivnosti soka od jabuke nakon tretmana gljivičnim lakazama i dvonedeljnog skladištenja u frižideru. Lakaze imaju sposobnost oksidacije fenolnih jedinjenja, što ih čini obećavajućim za upotrebu u raznim industrijskim procesima, uključujući bistrenje soka. Ova studija je ispitala lakaze iz *Pleurotus ostreatus* NRC 620, fokusirajući se na idealne uslove za njihovu aktivnost i efikasnost u bistrenju soka. Dok su istraživanja bukovača (P. ostreatus NRC 620) još uvijek ograničena, prethodne studije su ispitivale enzime iz različitih gljivičnih izvora, kao što su Trametes versicolor i Ganoderma lucidum. Cilj ove studije bio je procijeniti potencijalnu primjenu ovog enzima u prehrambenoj industriji i istaknuti njegova jedinstvena svojstva, posebno njegov idealan pH i temperaturu.
2,2′-Azooksibis(3-etilbenzotiazolin-6-sulfonska kiselina) (ABTS) je kupljen od Sigma-Aldrich (Kanada). Svi ostali reagensi su bili analitičke čistoće.
Centar za sakupljanje mikrobnih kultura Nacionalnog istraživačkog centra nabavio je poznati soj bukovače NRC620. Nakon subkultivacije, ovaj soj je čuvan na kosim agarima krompirove dekstroze na 4°C. Metoda pripreme inokuluma bila je sljedeća: 10 dana star, potpuno razvijen micelijum inokuliran je na ploče s agarima krompirove dekstroze i inkubiran na 28°C. Nakon 10 dana, tri micelijska bloka promjera 12 mm uklonjena su iz agara pomoću sterilnog metalnog bušila i stavljena u Erlenmeyerove tikvice od 250 mL s pamučnim čepovima koje sadrže 50 mL steriliziranog medija za kulturu (pH 5,0, kako je prethodno opisano od strane Othmana i suradnika...).20). Kulture su inkubirane na 28°C tokom 18 dana. Kulture su zatim filtrirane kroz Whatman br. 1 filter papir, a dobiveni supernatant je služio kao izvor enzima.
Aktivnost lakaze određena je korištenjem ABTS-a kao supstrata. Reakcijska smjesa (2 mL) sadržavala je 500 μL 0,3 mM ABTS-a (rastvorenog u 0,1 M natrijum citratnom puferu, pH 4,5) i potrebnu količinu uzorka enzima razrijeđenog destilovanom vodom.21,22S obzirom na to da lakaza može oksidirati ABTS na sobnoj temperaturi (28 °C ± 2), oksidacija ABTS-a je određena mjerenjem povećanja apsorbancije na 420 nm (ε420= 36.000 cm-1 M -1) korištenjem Agilent Carry-100 UV spektrofotometra. Jedna jedinica lakazne aktivnosti bila je potrebna za oksidaciju 1 μmol ABTS-a po minuti. Koncentracija proteina određena je Bradfordovom metodom korištenjem goveđeg serumskog albumina kao interne kontrole.23,24
Nakon dobijanja enzima iz soja bukovače NRC 620, njegova aktivnost je mjerena u različitim intervalima kultivacije tokom 25 dana pod statičkim uslovima na 28 °C.
Da bi se proučio uticaj temperature na aktivnost lakaze, eksperimenti su provedeni u temperaturnom rasponu od 20 do 90 °C. Prije dodavanja enzima i početka reakcije, pufer (0,1 M natrijum citrat, pH 4,5) i supstrat (ABTS) su pomiješani i inkubirani 5 minuta na različitim temperaturama. Termička stabilnost enzima procijenjena je inkubacijom u 0,05 M natrijum fosfatnom puferu (pH 7,0) na 40, 50, 60 i 70 °C tokom 2 sata, respektivno. Preostala aktivnost je zatim procijenjena korištenjem ABTS supstrata.
Utjecaj pH na aktivnost lakaze procijenjen je korištenjem ABTS-a kao supstrata u 0,1 M citrat-fosfatnim puferima s pH rasponom od 2,5 do 7,0. Rastvor enzima inkubiran je na 40°C dva sata u 0,1 M citratnom i Tris puferima (pH 3, 4, 6 i 7) kako bi se procijenila stabilnost pH. Preostala aktivnost s ABTS-om kao supstratom izračunata je nakon inkubacije.
Lakaza je inkubirana 10 minuta u natrijum fosfatnom puferu (0,05 M, pH 7,0) koji sadrži različite metalne ione (Mg2+, Cu2+, Co2+, Ca2+, Zn2+, K+, Na+ i Mn2+) u koncentracijama od 2,5 mM i 10 mM, respektivno. Zatim je dodan supstrat (ABTS) da bi se pokrenula reakcija, a zatim je procijenjena relativna aktivnost.
Oksidacija ABTS-a lakazom pri različitim koncentracijama (0,025–3 mM) mjerena je pri pH 4,5 kako bi se odredili kinetički parametri (Vmax i Km).konstanteMichaelis-Mentenove jednačine izračunate su korištenjem Lineweaver-Burk grafikona, koji prikazuje recipročnu vrijednost brzine reakcije kao funkciju koncentracije supstrata. Kinetičke konstante izračunate su iz Lineweaver-Burk grafikona korištenjem softvera GraphPad Prism verzije 6.01.
Nakon temeljitog pranja jabuka vodom iz slavine, prerezane su na pola i iscijeđene pomoću potpuno automatskog sokovnika za jabuke Braun MP80 (proizveden u Njemačkoj). Sok je filtriran kroz četiri sloja gaze. Kontrolnoj grupi nisu dodavani enzimi, dok je 2,0% lakaze (najefikasnija testirana koncentracija) dodano u svježe pripremljeni sok od jabuke, koji je zatim čuvan na 4°C dvije sedmice.
Titrabilna kiselost (TA) i pH su određeni prema metodi Boultona i dr.al.27pH vrijednost svakog uzorka je mjerena digitalnim pH metrom (JENWAY 3510 pH metar). Titrabilna kiselost (TA) je izračunata na osnovu jabučne kiseline korištenjem sljedeće formule.
Gdje su V i C volumen (mL) i koncentracija (0,1 mol/L) otopine natrijevog hidroksida korištene u titraciji. K je koeficijent konverzije jabučne kiseline, jednak 0,067, a W je masa (g) soka od jabuke.
Ukupne rastvorljive čvrste materije (TDS) sadržaj svih uzoraka soka određen je pomoću džepnog refraktometra PAL-1 (ATAGO, Tokio, Japan). Nakon svakog mjerenja, optičko sočivo je isprano deioniziranom vodom, a svaki uzorak soka od jabuke testiran je tri puta. Vrijednost za svaki uzorak izračunata je prosjekom tri mjerenja. Srednja vrijednost ± standardna devijacija za svaki uzorak soka od jabuke također je izračunata prosjekom ovih rezultata.
Viskoelastičnost uzoraka soka od jabuke procijenjena je pomoću rotacionog viskozimetra (RV, Rheotest 2, Njemačka). Uzorak je smješten unutar cilindra "S2" viskozimetra. Prividna viskoznost predstavljena je nagibom krivulje napona smicanja u odnosu na brzinu smicanja, koja je izračunata iz napona smicanja i odgovarajućih krivulja pri različitim brzinama smicanja (od 1,00 do 437,4 s⁻¹). Formula za izračunavanje prividne viskoznosti je sljedeća:
Gdje je η prividna viskoznost (cP), τ je napon smicanja (dyn/cm²), γ je brzina smicanja (sec⁻¹), a (τ) se izračunava korištenjem vrijednosti momenta (α) i cilindra (Z) koristeći sljedeću formulu: τ = Z . α.
Indeks smeđe boje određen je prema metodi Meidav-a ial.29Uzorak soka od 10 ml centrifugiran je na 2750 xg tokom 10 minuta. 5 ml supernatanta soka pomiješano je sa 5 ml 95% etanola. Apsorbancija smjese mjerena je na 420 nm pomoću Shimadzu UV spektrofotometra (UV-1601 PC).
Ukupni sadržaj fenola (TPC) određen je kolorimetrijski korištenjem Folin-Ciocalteu reagensa kako je opisano od strane Boulton et al.[27]]. Standardna krivulja galne kiseline konstruirana je za koncentracije od 0 do 500 mg/L (r²= 0,997). Rezultati su izraženi kao ekvivalenti galne kiseline (mg GAE/mL).
Dodajte 125 μL destilovane vode i 2850 μL FRAP rastvora u 25 μL soka od jabuke i ostavite smjesu u mraku30min. Zatim izmjerite apsorbanciju na 593 nm pomoću Shimadzu UV spektrofotometra (UV-1601 PC). FRAP reagens je pripremljen miješanjem 300 mM acetatnog pufera (pH 3,6), 20 mM željeznog(III) hlorida i 10 mM 2,4,6-tris(2-piridil)triazina (TPTZ) (rastvorenog u 40 mM HCl) u omjeru 10:1:1. Standardna krivulja je generirana korištenjem Troloxa kao standarda (R²= 0,999), a rezultati su izraženi kao μM Trolox/mL.
Antioksidativna aktivnost tretiranih i netretiranih sokova određena je DPPH metodom kako bi se procijenila njihova sposobnost uklanjanja DPPH slobodnih radikala.31Deset mikrolitara soka pomiješano je sa 1 ml rastvora DPPH (100 μM) u metanolu. Nakon reakcije u mraku tokom 30 minuta, apsorbancija smjese izmjerena je na 517 nm pomoću Shimadzu UV spektrofotometra (UV-1601 PC). Rezultati su izraženi kao ekvivalenti troloksa (μM troloksa/ml) na osnovu kalibracijske krive (R2= 0,990).
Dobijeni podaci pokazali su da je maksimalna proizvodnja lakaze uočena u bukovačama NRC 620 do kraja 18. dana fermentacije, dostižući aktivnost od 1302 U/L. Ovo je poslužilo kao osnova za određivanje optimalnog vremena kultivacije za proizvodnju lakaze (Slika 1). Iako se proizvodnja enzima povećavala s povećanjem vremena kultivacije, stopa povećanja nije bila direktno proporcionalna vremenu kultivacije; nakon 21 dan, aktivnost enzima se povećala za samo 90 U/L (na 1390 U/L). Stoga je 18 dana na kraju odabrano kao optimalno vrijeme kultivacije kako bi se uravnotežio prinos proizvoda s ekonomskim koristima povećanog vremena kultivacije.
Utjecaj vremena kultivacije na prinos lakaze kod Pleurotus ostreatus NRC 620. Tri (12 mm) bloka micelija gljivica inokulirana su u 50 ml sterilnog medija, a zatim kultivirana na 28 °C tokom različitih vremenskih perioda.
U skladu s drugim studijama, naši rezultati pokazuju da je idealan period kultivacije za postizanje vrhunca lučenja lakaze od strane gljiva vjerovatno između 7 i 36 dana.32Prema Ezikeu i saradnicima.33, *Trametes polyzona* WRF03 je proizveo najveću količinu lakaze do kraja devetog dana fermentacije, sa specifičnom aktivnošću od 1637 U/mg proteina. Nadalje, Othman i sar.34utvrđeno je da *Trichoderma harzianum* S7113 luči veliku količinu lakaze petog dana kulture. Brzina proizvodnje lakaze dostigla je vrhunac aktivnosti četrnaestog dana, a zatim se postepeno smanjivala.34Iako se lučenje enzima može javiti i tokom glavne faze rasta, ono obično dostiže vrhunac tokom međufaze i pokreće ga konzumiranje izvora ugljika ili dušika.34,35
Iako je lakaza iz Pleurotus ostreatus NRC 620 pokazala visoku aktivnost u širokom temperaturnom rasponu od 50°C do 80°C, približavajući se vrhuncu aktivnosti (69–98%), njena maksimalna aktivnost je uočena na 70°C (Slika 2a). Izvan ovog temperaturnog raspona, aktivnost enzima se smanjila na približno 70°C. Ovi rezultati ukazuju na to da je enzim aktivan na visokim temperaturama, vjerovatno zato što visoka temperatura povećava kinetičku energiju reakcije.
Utjecaj temperature reakcije (a) i pH (b) na aktivnost lakaze u *Pleurotus ostreatus* NRC 620. Temperature u rasponu od 20 do 90 °C postignute su prethodnom inkubacijom smjese na različitim temperaturama tokom 5 minuta prije dodavanja enzima i početka reakcije. Utjecaj pH na aktivnost lakaze procijenjen je korištenjem ABTS-a kao supstrata u otopinama koje sadrže 0,1 M citrat-fosfatnog pufera u rasponu pH od 2,5 do 7,0.
Prema Ezikeu i dr.al.33Optimalna temperatura za lakazu *Trametes polyzona* WRF03 je 55 °C, što je isto kao i za *Ganodermu lucidum*.laccase36i slično optimalnoj temperaturi (50 °C) za *Trametes polyzona* KU-RNW02737lakaza . Baldrian38napominje da je, kao i za druge enzimske sisteme koji razgrađuju lignin, idealan temperaturni raspon za lakazu između 50 i 70 °C.
Rezultati su pokazali da je enzim pokazao najveću aktivnost pri pH 3,0, dostižući 94% aktivnosti pri pH 3,5. Međutim, ostao je aktivan u širokom rasponu pH vrijednosti od 2,5 do 7,0 (Slika 2b). Nadalje, pokazao je veću aktivnost u kiselim uslovima u poređenju sa neutralnim ili alkalnim uslovima. Njegova aktivnost ostala je najmanje 77% u rasponu pH vrijednosti od 2,5 do 4,5, ali je dostigla samo približno 38% pri pH 7,0. Optimalni pH za lakazu iz *Trametes polyzona* WRF03 bio je 4,533, što je isto kao pH za lakaze iz *Trametes polyzona* KU-RNW02737, *Trichoderma harzanium* 39, *Pleurotus* sp. 40 i *Trametes hirsuta* 41. Međutim, prema studiji Chairina i saradnika...42, optimalni pH za lakazu iz *Polymorpha f. sp.* WR710-1 je 2,2, dok je optimalni pH za lakazu iz *Polymorpha f. sp.* IBL-04 5,043. Vezivanje hidroksidnih aniona (inhibitor lakaze) za atome bakra T2/T3 lakaze može biti razlog smanjene aktivnosti lakaze u neutralnim ili alkalnim pH uslovima. To može poremetiti unutrašnji prenos elektrona iz T1 centra u T2/T3 centar, čimeograničavajućiaktivnost enzima23,44
Inkubacijom enzima na različitim temperaturama, utvrđeno je da i vrijeme inkubacije i temperatura utiču na stabilnost enzima. Primijetno je da je lakaza iz *Trametes polyzona* NRC 620 pokazala veću stabilnost na 40℃ i 50℃, zadržavajući 68,33% odnosno 59,61% svoje početne aktivnosti nakon 120 minuta (Slika 3a). Nasuprot tome, pod istim uslovima (40℃ i 50℃, 120 minuta), lakaza iz *Trametes polyzona* WRF03 zadržala je 64,38% odnosno 42,92% svoje aktivnosti.33Naprotiv, povećanje vremena inkubacije i temperature smanjilo je stabilnost lakaze *Trametes polyzona* NRC 620; Nakon inkubacije na 60℃ i 70℃ tokom 60 minuta, njena aktivnost se smanjila na 39,24% odnosno 1,72% (Slika 3a). U skladu s eksperimentalnim rezultatima, lakaza iz *Trametes polyzona* WRF03 pokazala je veću stabilnost na 40 i 50℃ tokom cijelog procesa termičke obrade.33Slično tome, Lueangjaroenkit i dr.al.37i predsjedavajući i dr.al.42izvijestili su o stabilnosti lakaza iz Trametes polyzona KURNW027 i Trametes polyzona WR710-1 na 50 °C tokom 1 sata. Kao koristan biokatalizator primjenjiv u različitim biotehnološkim oblastima, lakaza bi trebala imati dobru stabilnost i performanse u širokom temperaturnom rasponu.
Termostatska stabilnost (a) i pH stabilnost (b) lakaze iz *Pleurotus ostreatus* NRC 620. Termostatska stabilnost je procijenjena inkubacijom rastvora enzima u 0,05 M natrijum fosfatnom puferu (pH 7,0) na 40, 50, 60 i 70 °C tokom 2 sata, respektivno. pH stabilnost je procijenjena inkubacijom rastvora enzima u 0,1 M citratnom puferu i Tris puferu (pH 3, 4, 6 i 7) na 40 °C tokom 2 sata. Preostala aktivnost je izračunata korištenjem ABTS-a kao supstrata nakon inkubacije.
Kako bismo odredili optimalne uslove za upotrebu i skladištenje enzima, istražili smo uticaj pH na stabilnost lakaze. Izloženost različitim pH vrijednostima značajno je uticala na stabilnost proteinske strukture, a time i na stabilnost i aktivnost molekula enzima. Rezultati su pokazali da je enzim bio manje stabilan u kiselim uslovima, dok je pokazao bolju stabilnost pri višim pH vrijednostima (neutralna i alkalna područja). Pri pH vrijednostima od 7,0, 6,0, 4,0 i 3,0, stope zadržavanja enzima nakon 120 minuta bile su približno 100%, 62,54%, 52,39% i 11,14%, respektivno (slika 3b). Lakaza *Strombus multisus* WRF03 pokazala je veću stabilnost pri neutralnim pH vrijednostima (5,5–6,5) i nižu stabilnost pri kiselim pH vrijednostima (ispod 4,0). Nakon 120 minuta pri pH vrijednostima od 5,5, 6,0 i 6,5, stope zadržavanja enzima bile su približno 82%, 100% i 93%, respektivno.33Khairin i dr.42primijetili su da je lakaza iz Trametes polyzona WR710-1 stabilna u rasponu pH vrijednosti od 6,0 do 7,0, dok su Sayed i suradnici...45pokazalo je da je lakaza stabilnija u uslovima neutralnog pH. Međutim, lakaza iz Cerrena unicolor je također pokazala stabilnost u alkalnim uslovima (pH 9,0).46Proučavane lakaze pokazale su visoku stabilnost u širokom rasponu pH vrijednosti. Ovo može biti važna karakteristika za industrijske primjene.
Budući da neki metalni ioni imaju i stimulativne i inhibitorne efekte na aktivnost enzima, njihov uticaj na aktivnost enzima mora se uzeti u obzir u industrijskim primjenama. Ovo je ključno jer su metalni ioni uobičajeni zagađivači okoline koji mogu uticati na stabilnost i sintezu ekstracelularnih enzima.47Kako bismo istražili efekte više metalnih iona na lakazu iz *Pleurotus ostreatus* NRC 620, proveli smo odgovarajuće eksperimente. Kao što je prikazano na Slici 4, ovisno o vrsti korištenog metala, povećanje koncentracije metalnih iona od 2,5 mM do 10 mM negativno je utjecalo na funkciju enzima. Na primjer,Mg²⁺ , Co²⁺ , Zn²⁺iCu²⁺mogao bi stimulirati i aktivirati aktivnost enzima, dokNa⁺ , Mn²⁺ , Ca²⁺iK⁺mogao je inhibirati aktivnost enzima. Pri koncentraciji od 10 mM, Cu²⁺ i Mg²⁺ ioni bili su najpotentniji aktivatori aktivnosti lakaze iz *Pleurotus ostreatus* NRC 620, pružajući stepen aktivacije od približno 34% odnosno 20%. Međutim, pri koncentraciji od 10 mM, Ca²⁺ ioni bili su najpotentniji inhibitor lakaze, smanjujući aktivnost enzima za približno 60%.
Utjecaj metalnih iona na aktivnost lakaze Pleurotus ostreatus NRC 620. Lakaza je inkubirana 10 minuta u natrij-fosfatnom puferu (0,05 M, pH 7,0) koji sadrži različite metalne ione u koncentracijama od 2,5 mM i 10 mM. Reakcija je zatim započeta dodavanjem supstrata (ABTS), nakon čega je izmjerena relativna aktivnost.
Naši rezultati su u skladu s rezultatima drugih autora koji su otkrili da Mg²⁺ i Cu²⁺ pojačavaju aktivnost *Trametes polyzona* WRF03³. Castaño i sar.⁴⁸ otkrili su da je lakaza iz *Xylaria* sp. donekle stimulirana ionima bakra (Cu²⁺). Nadalje, Foroutanfar i sar.⁴⁹ i Si i sar.⁵⁰ proveli su slične studije na lakazama iz *Paraconiothyrium variabile* i *Trametes pubescens*, respektivno. Mjesto vezivanja bakra tipa II (T2) ovog enzima može biti zasićeno s Cu²⁺ pri datoj koncentraciji, što može objasniti stimulaciju aktivnosti lakaze pri višim koncentracijama Cu²⁺³⁹. Budući da su lakaze gljiva bijele truleži oksidaze koje sadrže više atoma bakra, efekti iona bakra na aktivnost lakaze su raznoliki i kreću se od stimulativnih i inhibitornih do neutralnih.⁵¹ Nasuprot tome, Zhou i saradnici[52]izvijestio je daCu²⁺inhibirao je aktivnost lakaze tajvanskog podzemnog termita (Odontotermes formosanus). Međutim, lakaze Cerena sp. HYB07[53]i Clitocybe maxima[54]nisu bili pod utjecajem iona bakra.
Specifičnost supstrata predstavljena je njegovim kinetičkim parametrima (Km i Vmax); što je jači afinitet vezivanja supstrata za enzim, to je niža vrijednost Km i veća specifičnost supstrata.3,21,55Kinetički parametri (Km i Vmax) lakaze iz *Pleurotus ostreatus* NRC 620 određeni su korištenjem GraphPad Prism 6.0 softvera crtanjem Lineweaver-Burk dijagrama (Slika 5). Kada se ABTS koristi kao supstrat, rezultati su bili 1,99 mM i 16217 μmol.min⁻¹ L⁻¹,respektivno. Elsayed i dr.21izvijestili su da su vrijednosti Km za oksidaciju ABTS-a bile 0,1 mM i 0,064 mM, respektivno, što ukazuje na visok afinitet izoenzima Lac A i Lac B za ABTS. Nadalje, vrijednosti Vmax bile su 0,182 μmolmin⁻¹i 0,603 μmolmin⁻¹, respektivno. Dobijena Km vrijednost bila je niža od one kod Trametes polyzona WRF03 (8,66 mM); nadalje, njihova Vmax vrijednost (1429 mmol min⁻¹) također je bilanižikada se koristi ABTS kao supstrat.33 Slično tome, Km vrijednosti koncentracija lakaze Lentinus squarrosulus MR13 i Trametes sp. AH28-2 bile su 0,0714 mM i 0,025 mM, respektivno, a Vmax vrijednosti bile su 0,0091 mM min−1 i 0,67 mM min−1 mg−1 (u odnosu na ABTS), respektivno.56,57
Ispitan je utjecaj koncentracije ABTS-a na aktivnost lakaze iz *Pleurotus ostreatus* NRC 620, te je nacrtan Lineweaver-Burk dijagram recipročne vrijednosti početne brzine reakcije u odnosu na koncentraciju ABTS-a. Oksidacijska reakcija ABTS-a s različitim koncentracijama (0,025–3,0 mM) lakaze mjerena je pri pH 4,5 kako bi se odredili kinetički parametri (Vmax i Km). Michaelis-Mentenove kinetičke konstante izračunate su korištenjem Lineweaver-Burk dijagrama recipročne vrijednosti brzine reakcije u odnosu na koncentraciju supstrata. Kinetičke konstante izračunate su iz Lineweaver-Burk dijagrama korištenjem softvera GraphPad Prism 6.01.
Tradicionalni enzimi za bistrenje, poput pektinaza, hidroliziraju pektinske tvari, smanjujući viskoznost i mutnoću. Oni učinkovito razgrađuju strukturne polisaharide i često se koriste u kombinaciji s drugim enzimima, poput celulaza i hemicelulaza, kako bi se poboljšao prinos i bistrina. Međutim, pektinaze ne ciljaju specifično na fenolne spojeve, koji su glavni uzročnici zamućenja i oksidativnog posmeđivanja, posebno u sokovima poput soka od jabuke i grožđa.58Nasuprot tome, lakaze kataliziraju oksidaciju fenolnih spojeva, polimerizirajući ih u veće, nerastvorljive molekule koje se mogu ukloniti sedimentacijom ili filtracijom. Ovaj mehanizam ne samo da poboljšava bistrinu, već i produžava rok trajanja soka smanjenjem vjerovatnoće oksidativnog posmeđivanja uzrokovanog fenolnim spojevima. Nadalje, procesi bistrenja na bazi lakaza mogu se provoditi pod blagim uvjetima obrade (pH 3,5–5,5, temperatura 25–40 °C), što ih čini pogodnim za delikatne sokove bez ugrožavanja njihovih nutritivnih ili organoleptičkih svojstava.59Studije su pokazale da tretman pektinazom može izbistriti sok za 1-2 sata, dok tretman lakaze obično zahtijeva duže vrijeme reakcije (3-6 sati) da bi se potpuno redukovali fenoli. Međutim, ovaj proces se može optimizirati imobilizacijom enzima ili kombinovanjem lakaze sa mehaničkim metodama bistrenja.60U ovoj studiji, enzimsko profiliranje sirovog ekstrakta otkrilo je značajnu aktivnost lakaze i α-amilaze, dok su aktivnosti pektinaze i ksilanaze bile izuzetno niske, a aktivnost celulaze nije detektovana. Stoga je smanjenje mutnoće i sadržaja fenola uglavnom posljedica djelovanja lakaze, dok bi promjena viskoznosti mogla biti djelomično posljedica djelovanja amilaze.
Tabela 1 prikazuje fizičko-hemijske parametre svježe cijeđenog soka od jabuke i uzoraka tretiranih lakazom. Rezultati su pokazali da je prinos svježe cijeđenog soka od jabuke (71,59%) bio niži nego kod uzoraka tretiranih lakazom (87,34%). Ovi rezultati su u skladu s nalazima Pilnika i Orangea.61, koji je naznačio da upotreba enzima u preradi voća može povećati prinos soka, poboljšati filtraciju i dobiti visokokvalitetan, bistar sok za koncentraciju. Povećanje prinosa soka uglavnom je posljedica povećanja sadržaja rastvorljivih šećera u soku. Tokom enzimske hidrolize voća, mezoglej i pektin u ćelijskim zidovima proizvoda se uništavaju i pretvaraju u rastvorljive supstance kao što su neutralni šećeri i kiseline.62.pH vrijednost soka od jabuke tretiranog enzimima bila je značajno niža nego kod kontrolne grupe (P < 0,05), a pH vrijednost obje grupe značajno se povećala tokom skladištenja (Tabela 1). Ovi rezultati su u skladu s rezultatima Marka i suradnika.63, koji je primijetio da se pH vrijednost soka od indijskog oraha smanjila nakon skladištenja nakon termičke obrade. Degradacija pektina i stvaranje galakturonske kiseline nakon tretmana enzimima mogu biti odgovorni za povećanje pH vrijednosti tokom skladištenja. pH vrijednost uzoraka tretiranih enzimima ostala je između 4,05 i 4,31 tokom cijelog skladištenja, dok se pH vrijednost netretiranog soka od jabuke kretao između 4,12 i 4,33.
Ukupna kiselost (TA) i netretiranih i uzoraka tretiranih lakazom pokazala je trend smanjenja s povećanjem vremena skladištenja (Tabela 1). Smanjenje kiselosti pripisano je konverziji organskih kiselina u ugljikohidrate ili enzimskim reakcijama, kao i oksidaciji tokom skladištenja soka.64Ukupna kiselost kontrolnog soka od jabuke i uzoraka tretiranih enzimima bila je niža nego kod drugih sokova (sok od jagode 0,9%, sok od šljive 2,2%, sok od kumkvata 1,0%, sok od kajsije 2,4%, sok od narandže 0,8%), ali slična kiselosti kod drugih sokova (npr. sok od kruške 0,3%).62Ove razlike u netretiranom svježe cijeđenom soku od jabuke mogu biti posljedica različitih faktora kao što su uslovi uzgoja, genetski faktori, nivo zrelosti i metode prerade.65Smanjenje ukupne kiselosti kontrolnog i soka od jabuke tretiranog lakazom u skladu je s rezultatima koje su predstavili Singh i suradnici.66u vezi sa smanjenjem ukupne kiselosti soka od jabuke Jin Nuo nakon 74 dana skladištenja. S druge strane, Oshmiansky i Wojdylo67nisu pronašli nikakve značajne promjene u kiselosti soka od jabuke prilikom proučavanja učinka tradicionalnih metoda bistrenja.
Rezultati prikazani u Tabeli 1 pokazuju da je vrijednost ukupnih rastvorljivih materija (TSS) u soku od jabuke tretiranom lakazom bila veća nego u netretiranom uzorku. Ovi rezultati su u skladu sa objavljenim studijama.68Nadalje, Tabela 1 pokazuje da je vrijednost ukupne sumnjive tvari (TSS) kontrolne grupe koja je pila sok od jabuke bila 9,58 u početnom trenutku i dostigla je 11,05 do kraja perioda skladištenja. Ove vrijednosti su niže od vrijednosti TSS-a svježeg soka od jabuke koje su prijavili Hamid i saradnici.69(11,2 i 11,80, respektivno). Vrijednost ukupnih rastvorljivih materija (TSS) uzoraka soka od jabuke tretiranih lakazom značajno se povećala, počevši od 11,23 i dostigavši 12,93 nakon dvije sedmice skladištenja na 4°C (Tabela 1). Slično povećanje TSS-a tokom skladištenja uočeno je i kod agruma, limuna i slatkih narandži. Povećanje ukupnih rastvorljivih materija (TSS) tokom skladištenja može biti posljedica hidrolize polisaharida (škroba) u monosaharide (šećere), povećanja koncentracije zbog dehidracije soka i razgradnje pektina u soku u rastvorljive materije. Povećanje ukupnih rastvorljivih materija (TSS) vjerovatno je posljedica povećanja rastvorljivih šećera, koji mogu nastati konverzijom pektina ili celuloze u rastvorljive šećere pektinom ili celulazom, respektivno, ili hidrolizom škroba u šećere, kako su izvijestili Hamed i saradnici.69.Učinak lakaze na svojstva soka od jabuke može se vizualno uočiti, jer sok od jabuke tretiran lakazom pokazuje bolju tečljivost i nižu viskoznost od netretiranog soka. Ovo zapažanje je zabilježeno u Tabeli 1; Viskoznost uzorka tretiranog enzimima bila je 1,87 cP, dok je viskoznost kontrolnog uzorka bila 2,95 cP. Ovo značajno smanjenje viskoznosti vjerovatno je posljedica većeg kapaciteta zadržavanja vode supstanci sličnih pektinu i formiranja kohezivne mrežne strukture.
U ovoj studiji, uticaj lakaze na indeks posmeđivanja (BI) soka od jabuke istražen je mjerenjem apsorbancije na 420 nm pomoću spektrofotometra. Rezultati su prikazani u Tabeli 1. Tokom skladištenja, BI uzoraka soka od jabuke, kako u tretiranoj tako i u netretiranoj grupi, pokazao je postepeni trend rasta. BI odražava stepen posmeđivanja i može poslužiti kaovažanindikator enzimskih i neenzimskih reakcija posmeđivanja. Apsorbancija se značajno povećala tokom skladištenja (P < 0,05). Na kraju skladištenja,A420Vrijednost uzoraka soka od jabuke u kontrolnoj i grupi tretiranoj enzimima povećala se za oko 217% odnosno 121% (Tabela 1). Rezultati pokazuju da tretman enzimima može efikasno smanjiti stepen posmeđivanja za oko 56%. Rezultati Bezerre i saradnika.[19]] su u skladu s našim rezultatima; Koristili su vlakna lakaze-glutaraldehida i kokosa za bistrenje soka od jabuke, smanjujući njegovu originalnu boju za 61%.
Iako polifenoli u voćnim sokovima imaju pozitivne nutritivne i terapeutske efekte na ljudski organizam, oni također mogu reagirati s proteinima, uzrokujući zamućenje soka, sedimentaciju ili mutnoću, čime se mijenja okus i aroma proizvoda i smanjuje njegov rok trajanja.71Cilj ove studije bio je sigurno smanjenje sadržaja fenolnih spojeva u soku od jabuke korištenjem lakaze iz Pleurotus ostreatus NRC 620. Rezultati prikazani u Tabeli 1 pokazuju da je ukupni sadržaj fenolnih spojeva u soku od jabuke tretiranom lakazom značajno smanjen prije skladištenja na 4 °C. Nadalje, ukupni sadržaj fenolnih spojeva također se smanjio tokom skladištenja u oba proučavana uzorka (Tabela 1). Istraživanje Sandrija i suradnika.72pokazalo je da sok od jabuke tretiran enzimima može zadržati svoju antioksidativnu aktivnost i sadržaj fenolnih spojeva. Međutim, rezultati studije koju su proveli Lettera i suradnici...73pokazuju da tretman soka od narandže gljivičnom lakazom može smanjiti sadržaj fenolnih spojeva u njemu i do 45%.
Pokazalo se da fenolni spojevi imaju svojstva kao što su hvatanje slobodnih radikala, redukcija i gašenje singletnog kisika, prijenos atoma vodika i doniranje elektrona slobodnim radikalima, što ih čini potentnim antioksidansima.74Stoga su u ovoj studiji korištene metode zasnovane na DPPH i FRAP za procjenu utjecaja lakaze na antioksidativnu aktivnost soka od jabuke uskladištenog u hladnjaku 14 dana (Tabela 2). Obje metode su pokazale povećanje antioksidativne aktivnosti tokom skladištenja, što može biti posljedica povećanja slobodnih fenolnih spojeva ili stvaranja produkata Maillardove reakcije (MRP), pri čemu su produkti Maillardove reakcije vjerovatno uzrok povećanja antioksidativne aktivnosti.75Neenzimske reakcije posmeđivanja (uključujući razgradnju askorbinske kiseline, Maillardove reakcije i kiselinom kataliziranu razgradnju šećera) proizvode smeđe pigmente (melanoidine). Međuprodukti razgradnje askorbinske kiseline i produkti razgradnje šećera (kao što su karbonilni spojevi) mogu reagirati s aminokiselinama putem Maillardovih reakcija.76Iako je proces posmeđivanja voća i povrća tokom skladištenja opsežno proučavan, naše razumijevanje ovih reakcija ostaje ograničeno.77U poređenju sa FRAP metodom, sok od jabuke tretiran lakazom pokazao je značajno nižu antioksidativnu aktivnost DPPH metodom (Tabela 2), a antioksidativna aktivnost svih uzoraka značajno se povećala s povećanjem vremena skladištenja. U ovoj studiji korištene su dvije različite metode za određivanje antioksidativne aktivnosti jer se njihovi principi razlikuju. DPPH metoda mjeri sposobnost neutralizacije slobodnih radikala, dok FRAP metoda mjeri sposobnost redukcije iona željeza. Stoga se preporučuje korištenje više metoda za određivanje antioksidativne aktivnosti kako bi se bolje razumjela antioksidativna aktivnost proučavanih uzoraka.78
Jedan od ključnih nalaza ove studije je da lakaza *Pleurotus ostreatus* NRC 620 pokazuje optimalnu aktivnost na 70°C i pH 3,0. U poređenju s drugim gljivičnim lakazama koje se obično koriste za bistrenje soka, kao što su lakaze *Trametes versicolor* i *Ganoderma lucidum*, *P. ostreatus* NRC 620 pokazuje veću termičku stabilnost i kiseliji pH. Lakaze iz *Trametes versicolor* i *Ganoderma lucidum* obično pokazuju optimalnu aktivnost u rasponu od 50-60°C i pri pH vrijednostima između 3,5 i 5,0. Ova razlika može doprinijeti poboljšanoj efikasnosti bistrenja soka, posebno za kisele sokove gdje je stabilnost pri nižim pH vrijednostima kritična. Jedinstvena karakteristika *P. U poređenju s drugim proučavanim gljivičnim lakazama, *Pleurotus ostreatus* NRC 620 pokazuje sposobnost efikasnog funkcionisanja u izazovnijim uslovima. Njegova viša optimalna temperatura aktivnosti ukazuje na potencijalne prednosti u industrijskim primjenama, kao što su brže reakcije i smanjena mikrobna kontaminacija. Njegov nizak pH, koji je pogodan za kiselu prirodu mnogih sokova, može biti koristan u procesima bistrenja sokova. Ovi rezultati opravdavaju daljnja istraživanja za primjenu u velikim razmjerima, čineći *Pleurotus ostreatus* NRC 620 održivom alternativom tradicionalnim izvorima gljivične lakaze. U poređenju s prethodnim studijama, otkrili smo da je optimalna temperatura 60°C, a optimalni pH 3,0. Nakon reakcije na 60°C tokom 80 minuta, lakaza *Ganoderma lucidum* je zadržala...46% njegove aktivnosti.79 Prema Kurniawati i Nicelle80Enzimi *Ganoderma lucidum* pokazuju odličnu do umjerenu stabilnost na 25°C i pH vrijednostima u rasponu od 5,0 do 8,0, te stabilnost na pH 6,0 i temperaturama u rasponu od 10 do 30°C. U ovoj studiji otkrili smo da su optimalni pH i temperatura za aktivnost enzima za *Pleurotus ostreatus* bili 3,0 i 70°C, respektivno. Nakon inkubacije na 40°C i 50°C tokom dva sata, enzim je zadržao 68,33% i 59,61% svoje aktivnosti, respektivno. Nadalje, lakaza Pleurotus ostreatus NRC 620 pokazala je visoku aktivnost u širokom temperaturnom rasponu od 50°C do 80°C, gotovo dostižući maksimalnu aktivnost (69%–98%), s maksimalnom aktivnošću uočenom na 70°C.
Zaključno, lakaza NRC620 iz bukovače, dobijena pod statičkim uslovima, pokazala je optimalnu aktivnost i stabilnost u različitim pH i temperaturnim uslovima, demonstrirajući superiorniju stabilnost u poređenju s drugim izvorima enzima. Dodatak 10 mM MgSO₄ i CuSO₄ povećao je aktivnost enzima za približno 21% odnosno 35%. Kada se preradi u sok od jabuke, enzim je smanjio pH i viskoznost, dok se sadržaj fenola samo neznatno smanjio tokom skladištenja.
Rezultati potvrđuju potencijal lakase u prehrambenoj industriji, posebno u bistrenju pića. Specifičnim razgradnjom fenolnih spojeva, lakasa ne samo da smanjuje mutnoću i poboljšava bistrinu, već i održava kvalitet voćnih sokova pod blagim uslovima rada. Za razliku od tradicionalnih sredstava za bistrenje poput želatine, bentonita i silika gela, lakasa ne stvara otpad niti uklanja ugodne arome iz pića, što je čini ekološki prihvatljivijom i održivijom opcijom. Nadalje, u poređenju s drugim enzimima i metodama filtracije, lakasa nudi ciljano i isplativo rješenje bez ugrožavanja kvaliteta proizvoda.
Kyomuhimbo, HD i Brink, HG. Primjena i strategije imobilizacije lakaza koje sadrže bakar; pregled. Heliyon 9, e13156 (2023).
Vrijeme objave: 15. decembar 2025.